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浙大研究刊登《科學》:“看清”鉀-氯共轉運蛋白的結構,為治療癲癇提供新思路

發布時間:2019-10-25來源:浙大新聞辦作者:盧紹慶等860

人體細胞內的鉀、鈉、氯等離子穩態是受到嚴格調控的,離子穩態一旦失衡,就會導致高血壓、抑郁、癲癇等一系列疾病。而在細胞膜上,有一類被稱為陽離子-氯離子共轉運蛋白的蛋白質,可以帶著離子進入和離開細胞,從而有效調控細胞內的離子穩態。不過長期以來,由于缺乏精確的結構信息,人們對這類蛋白的工作機理還不甚了解。

近日,浙江大學醫學院郭江濤課題組解析了這類蛋白質中的一個成員——人源鉀-氯共轉運蛋白KCC12.9埃的高分辨率冷凍電鏡結構,揭示了鉀離子和氯離子的結合位點,提出一個鉀-氯共轉運機理的模型,這將為相關的疾病治療和藥物設計提供新的視角。

1025日,這項研究刊登在國際頂級雜志《科學》(Science)上。浙江大學醫學院劉斯博士、冷凍電鏡中心常圣海博士和物理系碩士生韓斌銘為文章的共同第一作者。

圖1. 人源KCC1的結構。(A)KCC1的二聚體結構;(B)KCC1的鉀離子與氯離子結合位點。

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一般來說,人體細胞內的鉀離子濃度是高于細胞外濃度的。鉀-氯共轉運蛋白KCC利用這個鉀離子濃度梯度,將細胞內的鉀離子和氯離子一起轉運至細胞外,從而調控細胞內的氯離子濃度。

氯離子濃度是一個很關鍵的指標。例如,在γ-氨基丁酸介導的抑制性神經傳遞過程中,抑制性神經元需要維持細胞內較低的氯離子濃度才能發揮正常的抑制作用。正是由于鉀-氯共轉運蛋白中的一個成員KCC2不停地將細胞內的鉀離子和氯離子轉運至細胞外,使得抑制性神經元細胞內能夠維持較低的氯離子濃度。如果KCC2發生突變,抑制性神經傳遞就會受到破壞,這樣一來神經元會持續放電,從而引發各種神經系統疾病,如癲癇等。

既然KCC的功能如此重要,為何科研人員長久以來都沒有揭開這個家族的面紗呢?

郭江濤研究員介紹說,這主要受限于兩方面的因素。首先,鉀-氯共轉運蛋白的樣品獲得不容易。要想做結構研究,首先得有溶液狀態下的大量、均一的蛋白樣品。但因為鉀-氯共轉運蛋白在細胞內的本底含量很低,為了獲得大量的蛋白樣品,就需要將蛋白的基因包裹在桿狀病毒中,用桿狀病毒感染大量的哺乳動物細胞進行過量表達。在蛋白純化過程中,由于鉀-氯共轉運蛋白是定位于細胞膜上的膜蛋白,具有很強的疏水性,在水溶液中膜蛋白不穩定,易于沉淀,需要溶解在雙親性的去污劑中。因此,鉀-氯共轉運蛋白的純化和樣品制備的過程比一般的水溶性蛋白更加復雜和困難。蛋白純化過程就像是大浪淘沙,培養幾升的細胞,經過逐步純化,最終才獲得100微克左右的蛋白樣品。

另一方面,較小分子量的膜蛋白的高分辨率結構解析一直具有挑戰性。如果采用傳統的晶體學解析這種膜蛋白結構,通常需要花費幾年的時間,而且就算投入大量的人力和經費,最終結果也往往不理想。近年來冷凍電鏡技術的發展為解析膜蛋白結構提供了便捷的途徑。不過,困難依舊存在。“冷凍電鏡通常對分子量大于150千道爾頓(道爾頓為相對原子質量單位,1道爾頓的質量等于1克的6.02×1023分之一)的蛋白質的結構解析非常有效,分辨率往往在3.5埃左右(1埃等于1米的一百億份之一);但對于小分子量蛋白質的高分辨率結構解析仍然比較困難。”郭江濤說,以KCC1為例,最終解析結構的部分的分子量只有120千道爾頓,分辨率為2.9埃,這對于一般的冷凍電鏡結構生物學研究來說,是很不容易的。

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劉斯經過大量的蛋白表達和純化條件的優化,最終獲得足夠量的可用于冷凍電鏡數據收集的KCC1蛋白樣品。此時,浙江大學冷凍電鏡中心的300kv的高性能冷凍電鏡Titan Krios派上了大用場。

然而,有先進的冷凍電鏡,也不一定拍出好照片。生物大分子樣品對曝光非常敏感,電子的輻射會讓其受損傷。拍照只能在曝光時間短、劑量低的情況下進行,但這也直接導致了拍攝噪音大。“拍到理想的照片真可謂是一波三折,課題組的研究從2017年就開始了,但真正拿到高分辨結構已經是2019年初了。”常圣海說。

為了減少電子對蛋白的輻射損傷,蛋白樣品需要在冷凍環境下進行數據收集。這又是個技術活。在數據收集前,科研人員用液態乙烷把蛋白溶液樣品快速冷凍在一張“銅網”上。銅網的每個目下面是一個方格,里面有幾百個通透的孔,蛋白顆粒就被玻璃態的冰層包裹在這些孔中。但是,問題又來了,一般的冰層厚度在100-200納米之間,而KCC1蛋白的直徑在8-10個納米之間,就好像要在十幾米深的泳池里尋找1米長的目標,噪音很大。

為了提高分辨率,劉斯和常圣海先是“削薄”冰層,然后再不斷調整參數,讓冷凍后的KCC1蛋白顆粒能夠密集而均勻地分布在冰層較薄的區域。這樣不僅可以顯著降低冰層的噪音,提高分辨率,而且可以增加每張照片的蛋白顆粒數量,提高數據收集效率。

電鏡數據收集的過程,有點像電影的拍攝手法:在8秒的時間內連續拍攝40張照片,形成一個“微電影”。科研人員通過圖像處理,將微電影“疊加”成一張照片,這樣可以顯著提高照片的信噪比,獲得更為清晰的畫面。課題組從3000多部“微電影”中,挑出了一兩百萬個蛋白顆粒進行數據處理。經過層層篩選,最終用十萬個左右的高質量的蛋白顆粒進行高分辨率三維重構。

課題組最終獲得了兩套2.9埃高分辨率的KCC1的三維結構。 “這項工作首先得益于近年來的冷凍電鏡技術的發展;劉斯和常圣海在蛋白樣品制備和數據收集處理方面的經驗和決心是課題取得進展的關鍵因素。”郭江濤這樣評價道。

令人興奮的發現

分析了KCC1的高分辨率三維結構后,研究人員發現KCC1是以二聚體的形式存在,它的跨膜區與胞外區均參與了二聚體的形成。在KCC1結構中,研究人員鑒定出一個鉀離子和兩個氯離子的結合位點;結合離子轉運實驗、分子動力學模擬、結構比較等方法,該研究闡明了KCC1以1:1的比例同時同向轉運鉀離子和氯離子的分子機理。

 “闡明分子機理,不僅需要高分辨率三維結構,而且需要離子轉運活性實驗、分子動力學模擬進行驗證。范德比爾特大學的EricDelpire和浙大物理系的李敬源團隊在這方面提供了專業的技術支持。”論文的資深作者葉升教授高度評價合作者的工作。

 “物質的跨膜運輸是人體細胞與外界進行物質、能量和信息交換的重要途徑”,郭江濤介紹說,“在轉運鉀離子和氯離子的過程中,KCC1就好像細胞膜上有一個旋轉門,朝內這一側的門先打開,離子結合到KCC1上進入旋轉門內;然后朝外這一側的門打開了,離子從旋轉門釋放到細胞膜外。”

圖2. KCC1共轉運鉀離子和氯離子的模型。第二個氯離子首先結合在第二位點,然后鉀離子和第一個氯離子結合;KCC1的構象由內向態向外向態轉變,鉀離子和第一個氯離子釋放至細胞外。

獲得了KCC1的高分辨率電鏡結構,將有助于下一步設計針對KCC的藥物,為治療癲癇等疾病提供幫助。文章審稿人認為:“這項工作揭示了一個令人興奮的人源轉運蛋白的結構。”

這項研究的主體工作在浙江大學完成,浙江大學冷凍電鏡中心為數據收集提供了大力支持。浙江大學醫學院的郭江濤研究員整合了德克薩斯大學西南醫學中心白曉辰團隊、浙江大學葉升團隊、范德比爾特大學的Eric Delpire團隊以及浙江大學物理系的李敬源團隊等研究力量,體現了跨學科合作的優勢。該工作還得到了浙江大學醫學院楊巍教授、冷凍電鏡中心主任張興教授的幫助。該研究受到國家自然科學基金委、科技部重點研發計劃等項目的資助。

論文鏈接:https://science.sciencemag.org/content/366/6464/505

(攝影 盧紹慶 圖片來源課題組)

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